單細(xì)胞擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)對操作細(xì)節(jié)要求較高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果會(huì)受到樣本處理、體系配制等多個(gè)環(huán)節(jié)影響。按照試劑盒配套要求執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)化操作，能夠減少實(shí)驗(yàn)過程中的人為偏差，保障實(shí)驗(yàn)過程穩(wěn)定，獲取可用的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)主要分為樣本前期準(zhǔn)備、樣本裂解處理、擴(kuò)增反應(yīng)體系配制、上機(jī)反應(yīng)等環(huán)節(jié)，其中樣本裂解與反應(yīng)體系配制屬于實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵步驟，需要落實(shí)對應(yīng)的實(shí)操規(guī)范。
 

　　開展實(shí)驗(yàn)之前，需要完成前期準(zhǔn)備工作。實(shí)驗(yàn)人員需要做好個(gè)人防護(hù)，穿戴實(shí)驗(yàn)防護(hù)用品，對實(shí)驗(yàn)操作臺(tái)進(jìn)行清潔處理。實(shí)驗(yàn)所用的移液器具、耗材需要確認(rèn)無核酸污染，耗材開封后盡量一次性使用，避免反復(fù)取用造成交叉污染。試劑盒內(nèi)各類組分取出后，放置在合適環(huán)境下進(jìn)行融化，融化過程中避免劇烈搖晃。全部試劑融化完成之后，輕柔顛倒混勻，通過低速離心將管壁附著的液體收集到管底，再放置于冰上待用。實(shí)驗(yàn)過程盡量在低溫環(huán)境下開展，減少試劑組分發(fā)生降解。
 

　　樣本裂解是單細(xì)胞擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)的前置步驟，直接關(guān)系后續(xù)擴(kuò)增效果。實(shí)驗(yàn)操作需要在潔凈的操作空間內(nèi)完成，避免環(huán)境中的外源核酸進(jìn)入樣本體系。待處理的單細(xì)胞樣本需要保持狀態(tài)穩(wěn)定，操作過程盡量縮短樣本在室溫下暴露的時(shí)間。將單細(xì)胞樣本轉(zhuǎn)移至裂解反應(yīng)管內(nèi)，操作時(shí)注意避免樣本出現(xiàn)丟失，同時(shí)防止樣本管內(nèi)壁沾染多余樣本。

  

　　加入裂解相關(guān)試劑時(shí)，移液操作要平穩(wěn)，試劑需要精準(zhǔn)加到反應(yīng)管底部，不要掛在管壁位置。試劑添加完成之后，輕柔吹打混勻樣本與裂解試劑，混勻動(dòng)作不宜用力過猛，防止產(chǎn)生大量氣泡。混勻結(jié)束后，做好短暫離心，使管內(nèi)全部液體匯集到管底。按照試劑盒規(guī)定的條件開展裂解孵育，孵育過程中保持環(huán)境條件穩(wěn)定，不要隨意挪動(dòng)反應(yīng)管。裂解結(jié)束之后，反應(yīng)產(chǎn)物可以短暫置于低溫環(huán)境暫存，不建議長時(shí)間放置，需要盡快進(jìn)入后續(xù)體系配制環(huán)節(jié)。裂解操作過程中，要區(qū)分樣本管與陰性對照管，做好標(biāo)記，避免樣本混淆。
 

　　擴(kuò)增反應(yīng)體系配制需要遵循分區(qū)操作原則，試劑配制區(qū)域和樣本處理區(qū)域分開，降低樣本之間交叉污染的可能性。配制體系前，再次核對試劑盒各組分狀態(tài)，確認(rèn)試劑沒有出現(xiàn)分層、沉淀等異常情況。配制體系時(shí)，建議在冰盒上進(jìn)行操作，維持試劑低溫狀態(tài)。
 

　　體系配制優(yōu)先配制預(yù)混液，將試劑盒內(nèi)對應(yīng)的各類試劑按照操作說明混合在一起。配制預(yù)混液的時(shí)候，移液要做到動(dòng)作輕柔，吸取試劑盡量避免產(chǎn)生氣泡。每加入一種試劑，完成移液之后可以輕輕吹打混勻，全部試劑添加完畢后，輕柔顛倒混勻預(yù)混液，之后進(jìn)行短暫離心，把管壁上殘留液體收集至管底。預(yù)混液配制完成之后，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，分裝到各個(gè)反應(yīng)管當(dāng)中。
 

　　向反應(yīng)管內(nèi)加入裂解后的樣本產(chǎn)物時(shí)，移液槍頭需要更換，避免不同樣本之間發(fā)生交叉污染。樣本加入反應(yīng)管后，輕柔吹打混勻管內(nèi)液體，混勻之后進(jìn)行離心，使全部液體匯集到管底。配制完成的反應(yīng)體系，需要檢查管內(nèi)是否存在氣泡，氣泡會(huì)干擾后續(xù)反應(yīng)進(jìn)程，如果出現(xiàn)氣泡，可以通過低速離心消除。
 

　　配制體系的全過程需要做好樣本記錄，對每一個(gè)反應(yīng)管做好清晰標(biāo)識(shí)，記錄樣本編號(hào)、處理時(shí)間等信息。配制結(jié)束后，盡快將反應(yīng)管放置到儀器當(dāng)中啟動(dòng)擴(kuò)增反應(yīng)，減少體系在室溫下停留的時(shí)長。實(shí)驗(yàn)過程中，需要同步設(shè)置對照樣本，對照樣本同樣按照相同的操作流程完成體系配制，用于判斷實(shí)驗(yàn)過程是否存在異常。
 

　　實(shí)驗(yàn)結(jié)束之后，需要對操作臺(tái)、移液器具進(jìn)行清潔。剩余試劑按照試劑盒說明進(jìn)行保存，耗材按照實(shí)驗(yàn)廢棄物相關(guān)要求處理。操作過程中如果出現(xiàn)試劑灑落、樣本管破損等情況，需要及時(shí)對區(qū)域進(jìn)行清潔處理，防止污染擴(kuò)散。
 

　　在實(shí)際實(shí)操當(dāng)中，需要留意一些常見問題。裂解環(huán)節(jié)如果混勻力度過大，容易造成樣本損傷；體系配制時(shí)如果產(chǎn)生較多氣泡，會(huì)影響反應(yīng)進(jìn)行。操作時(shí)盡量保持動(dòng)作連貫，減少不必要的反復(fù)開蓋，降低環(huán)境污染物進(jìn)入反應(yīng)體系的概率。
 

　　標(biāo)準(zhǔn)化的樣本裂解與擴(kuò)增體系配制，是單細(xì)胞擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蝽樌_展的基礎(chǔ)。嚴(yán)格遵循操作流程，把控每一步的操作細(xì)節(jié)，能夠降低實(shí)驗(yàn)干擾因素，保障實(shí)驗(yàn)過程的重復(fù)性，為后續(xù)的數(shù)據(jù)分析提供可靠的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。